蛋白印跡發的原理是什么？蛋白印跡法的操作步驟是什么？

蛋白質印跡法是由瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所的Harry Towbin在1979年提出的。在尼爾·伯奈特于1981年所著的《分析生物化學》中首次被稱為Western Blot。蛋白免疫印跡是將電泳分離后的細胞或組織中蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。

蛋白印跡發的原理是什么?

與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

蛋白印跡法的操作步驟是什么?

試劑準備

1、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。

2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.0ml;10%SDS6.0ml;β-巰基乙醇0.2ml;ddH2O 2.8ml。

3、轉膜緩沖液：甘氨酸2.9g;Tris5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24g;加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮藍0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脫脂奶粉，現配)：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6.0mg;0.01M PBS 10.0ml;硫酸鎳胺 0.1ml;H2021.0μl。

樣品制備

1、單層貼壁細胞總蛋白的提?。?/p>

(1)倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液(或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。

(2)每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS(0.01M pH7.2～7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。

(3)按1ml裂解液加10 μlPMSF(100mM)，搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。)

(4)每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

(5)裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側(動作要快)，然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中(整個操作盡量在冰上進行)。

(6)于4℃下12000rpm離心5min(提前開離心機預冷)。

(7)將離心后的上清分裝轉移到0.5ml的離心管中放于-20℃保存。

2、組織中總蛋白的提?。?/p>

(1)將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。

(2)加400 μL單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。

(3)幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。

(4)裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

3、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取：由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按(一)操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：

(1)將培養液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。

(2)棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。

(3)用槍洗干上清后，加100 μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

(4)將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。

含量測定

1、制作標準曲線

(1 )從-20℃取出1mg/mlBSA，室溫融化后，備用。

(2) 取18個1.5ml離心管，3個一組，分別標記為0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。

2、檢測樣品蛋白含量

(1)取足量的1.5ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測蛋白。

(2 )取一管考馬斯亮藍加0.15mol/LNaCl溶液100ul，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。

(3 )棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL)，再用無菌水洗一次。

(4) 取一管考馬斯亮藍加95ul 0.15mol/LNaCl溶液和5ul待測蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5ul樣品含的蛋白量。